百螢-Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方案

 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒是百螢生物生產(chǎn)的一種基于 WST-8 的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。百螢生物是 AAT Bioquest 中國(guó)區(qū)域代理商，為國(guó)內(nèi)提供 AAT 的原裝產(chǎn)品及產(chǎn)品定制、技術(shù)服務(wù)，歡迎咨詢(xún)、訂購(gòu)！

實(shí)驗(yàn)方案

1.在96 孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100μL2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100μL5000個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行培養(yǎng)（在37°C，5%CO2的條件下）預(yù)培養(yǎng)24 小時(shí)。

2.向培養(yǎng)板加入1-10μL 不同濃度的待測(cè)藥品刺激。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24 或48 小時(shí)）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD 值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類(lèi)推?？梢杂眉恿讼鄳?yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。如果擔(dān)心所使用的**會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥品和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。

5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類(lèi)型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，如無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長(zhǎng)，例如650nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

7.如果暫時(shí)不測(cè)定OD 值，打算以后測(cè)定的話(huà)，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加CCK 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥品影響。當(dāng)然藥品影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥品后的空白吸收即可。

注意事項(xiàng)：

1.由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)的問(wèn)題。一方面，由于96孔板周?chē)蝗θ菀渍舭l(fā)，可以采取棄用周?chē)蝗Φ霓k法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性的原理是通過(guò)檢測(cè)活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測(cè)體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)法去除。

3.建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

4.建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK 試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加樣，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD 值讀數(shù)。

5.當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)，且培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)一些。如果要使用24 孔板或6 孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色已變化或pH值變化。建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

7.如果沒(méi)有450nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm 濾光片的檢測(cè)靈敏度高。

8.酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無(wú)明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

9.為了您的健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

實(shí)驗(yàn)圖：

圖 2. CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性原理圖

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